人胰島素（Insulin）酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
檢測范圍：                                                                                                                    96T
0.5mU/L – 16mU/L
 
使用目的：
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中胰島素（Insulin）含量。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人胰島素（Insulin）水平。用純化的人胰島素
（Insulin）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入胰島素（Insulin），再
與 HRP 標(biāo)記的胰島素（Insulin）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后
加底物TMB顯色。TMB在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃
色。顏色的深淺和樣品中的胰島素（Insulin）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度
（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人胰島素（Insulin）濃度。  
試劑盒組成  
1  30倍濃縮洗滌液  20ml×1瓶  7  終止液  6ml×1 瓶
2  酶標(biāo)試劑  6ml×1瓶  8  標(biāo)準(zhǔn)品（32mU/L）  0.5ml×1 瓶
3  酶標(biāo)包被板  12 孔×8條  9  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液  1.5ml×1 瓶
4  樣品稀釋液  6ml×1瓶  10  說明書  1 份
5  顯色劑A 液  6ml×1瓶  11  封板膜  2 張    
6  顯色劑B液  6ml×1/瓶  12  密封袋  1 個(gè)
標(biāo)本要求  
1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能
馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1.  標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀
釋。
16mU/L  5 號標(biāo)準(zhǔn)品  150µl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
8.0mU/L  4 號標(biāo)準(zhǔn)品  150µl的5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
4.0mU/L  3 號標(biāo)準(zhǔn)品  150µl的4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.0mU/L  2 號標(biāo)準(zhǔn)品  150µl的3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1.0mU/L  1 號標(biāo)準(zhǔn)品  150µl的2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
 
 
2.  加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同） 、標(biāo)準(zhǔn)孔、
待測樣品孔。 在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50µl， 待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl，然后再加待測樣品10µl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.  溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。      
4.  配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復(fù) 5次，拍干。
6.  加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50µl，空白孔除外。  
7.  溫育：操作同3。
8.  洗滌：操作同5。
9.  顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10.  終止：每孔加終止液 50µl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色） 。
11.  測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD 值） 。 測定應(yīng)在加終止
液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
操作程序總結(jié)：
 
 
計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的
OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式， 將樣品的OD值代入方程式， 計(jì)算出樣品濃度， 再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。  
注意事項(xiàng)
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD 值） ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計(jì)
算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5） 。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存： ；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Human          Insulin
 
FOR RESEARCH USE ONLY
 
Assay range：0.5mU/L -16 mU/L                                96 determinations
Purpose
This kit allows  for  the determination of  Insulin concentrations  in Human serum, cell
culture supernates and other biological fluids
 
Principle of the assay
The kit assay Human Insulin level in the sample， use Purified Human Insulin antibody to
coat microtiter  plate  wells, make  solid-phase  antibody,  then  add  Insulin  to  wells,  Combined
Insulin  antibody  which  With  HRP  labeled  goat  anti-Human  become  antibody  -  antigen  -
enzyme-antibody  complex,  after  washing  Compley,  Add  TMB  substrate  solution,TMB
substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition
of  a  sulphuric  acid  solution  and  the  color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm. The concentration of Human Insulin in the samples is then determined
by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
Materials provided with the kit
1  wash    solution  20ml×1bottle  7  Stopp Solution  6ml×1 bottle
2  HRP-Conjugate reagent  6ml×1 bottle  8  Standard （32mU/L）   0.5ml×1 bottle
3  Microelisa stripplate  12well×8strips  9  Standard diluent  1.5ml×1bottle
4  Sample diluent  6ml×1 bottle  10  Instruction  1
5  Chromogen Solution A  6ml×1 bottle  11
Closure plate
membrane
2
6  Chromogen Solution B  6ml×1 bottle  12  Sealed bags  1
Specimen requirements
RD 1.  extract  as  soon  as  possible  after  Specimen  collection,and  according  to  the  relevant
literature,  and  should  be  experiment  as  soon  as  possible  after  the  extraction.  If  it  can’t,
specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.
2.  Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.
Assay procedure
1.  Dilute and add sample:Dilute Original density Standard as follow table:
16mU/L
5 Standard  150µl Original density Standard+150µl Standard diluent
8mU/L
4 Standard  150µl 5 Standard+150µl Standard diluent
4mU/L
3 Standard  150µl 4 Standard+150µl Standard diluent
2mU/L
2 Standard  150µl 3 Standard +150µl Standard diluent
1mU/L
1 Standard  150µl 2 Standard +150µl Standard diluent
2.add  sample：Set  blank  wells  separay  （blank  comparison  wells  don’t  add  sample  and
HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same）. testing sample well. add Sample
dilution  40µl  to  testing  sample  well,  then  add  testing  sample  10µl  （sample  final  dilution  is
5-fold）, add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.
3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.
4.Configurate  liquid: 30-fold  （or 20-fold） wash solution diluted 30-fold  （or 20-fold） with distilled
water and reserve.
5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer
to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.
6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50µl to each well, except    blank well.  
7.incubate：Operation with 3.
8.washing：Operation with 5.
9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B  to each well, evade  the
light preservation for 15 min at 37℃
10.Stop  the  reaction：Add  Stop  Solution50µl  to  each well,  Stop  the  reaction（the  blue  color
change to yellow color）.
11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and within 15min.
Steps description
Standard, Sample diluent
 
 
Add Standard, Sample diluent, incubate for 30 min at 37℃.
 
 
Wash 5 time,Add HRP-Conjugate reagent, incubate for 30 min at 37℃.
 
 
Wash 5 times,Add Chromogen Solution A and B, incubate for 30 min at 37℃.
 
 
Add Stopp Solution
 
 
Read absorbance at 450nm within 15 min
 
 
calculate
Calculate
Take  the  standard  density  as  the  horizontal,  the OD  value  for  the  vertical  ,draw  the
standard  curve on graph paper, Find out  the  corresponding density according  to  the  sample
OD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with the
sample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor,
the result is the sample actual density.
Important notes
1.  The kit  takes out  from  the  refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes  in
the room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should
be stored in Sealed bag.
2.  washing  buffer  will  Crystallization  separation,  it  can  be  heated  the  water  helps  dissolve
when dilute . Washing does not affect the result.
3.  add  Sample  with  sampler  Each  step,  And  proofread  its  accuracy  frequently,  avoids  the
experimental error. add sample within 5 min, if the number of sample is much , recommend
to use Volley .
4.  if the testing material content is excessively higher （The sample OD is bigger than the first
standard well ）,please dilute Sample （n-fold）, Please diluente and multiplied by the dilution
factor.（×n×5）.
5.  Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.
6.  The substrate evade the light preservation.
7.  Please  according  to  use  instruction  strictly,  The  test  result  determination must  take  the
microtiter plate reader as a standard.
8.  All samples, washing buffer and each kind of  reject should according  to  infective material
process.
9.  Do not mix reagents with those from other lots.
 
Storage and validity
1．Storage：    2-8℃.
2．validity：  six months